新农产品食品检验员培训考证适用生产许可检查-培养基(料)的消毒灭菌
一、培养基(料)的灭菌方法
食用菌培养基(料)的消毒灭菌是指对培养基(料)中的微生物进行杀灭,它是对食用菌纯培养的必要条件,一般采用热力灭菌、拌药消毒等方法。
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1、热力灭菌
热力灭菌是利用高温使菌体蛋白变性,从而失去活性,达到灭菌的目的。热力灭菌常采用湿热灭菌的方法对培养基质进行灭菌,因为热蒸汽的穿透力强,蛋白质的凝固点随含水量的增加而降低。根据采用不同的仪器、温度、时间及压力指标分为高压蒸汽灭菌、常压灭菌、常压间歇灭菌、发酵杀菌(巴氏消毒)等方法。
①高压蒸汽灭菌即将灭菌物置于密封的高压锅内,利用加压高温蒸汽在较短的时问内达到彻底灭菌的方法。一般液体培养基在1公斤/平方厘米的压力下,处理20~30分钟,温度约为℃。对固体培养基,如木屑、棉籽壳、谷粒、粪草等,必须在1.5公斤/平方厘米的压力下,处理1~2小时,温度约为℃,才能达到满意的灭菌效果。使用高压锅的步骤为:加水至水位线→装锅→加盖→加热升温→压力至0.5公斤/平方厘米时,打开排气阀排除锅内冷空气,压力降至0,排气阀有大量热蒸汽冲出时,关闭排气阀→继续升温,压力升至规定指标,温度达到规定指标时,开始调火稳压规定时间→灭火→降压→开盖→取物。
②常压灭菌常压灭菌将灭菌物置于常压灭菌锅内,以自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。常压灭菌灶的建造方法根据各地习惯而异。常压灭菌的时间通常以见冒大气(℃)开始计算,一般维持8~10小时。灭菌时注意不要将灭菌物排得过密,以保证灭菌锅内的蒸汽流通。开始要求以旺火猛攻,使灭菌灶内的温度尽快上升至℃,中途不能停火,经常补充热水以防蒸干。此法的优点是建灶成本低、容量大,但灭菌时间长、能源消耗量大。
③常压间歇灭菌在没有高压灭菌设备的条件下,或对一些不宜用℃以上温度而又须杀灭其中的细菌芽孢的物质的灭菌,可采用此法。具体做法是:将培养基或其他灭菌物置于灭菌锅里,经℃的热蒸汽30~分钟,杀死细菌的营养体,然后将灭菌物取出,置于25~30℃条件下培养24小时,诱发其中残留的芽孢萌发成营养体,再放入灭菌锅内灭菌30分钟,以杀死新萌发的营养体。如此连续3次,即可杀死灭菌物的芽孢、厚垣孢子。
④发酵杀菌在食用菌生产中经常采用培养料堆制发酵的方法,由微生物的代谢热所产生的高温,使培养料发酵腐熟的同时,杀死培养料中杂菌的营养体、害虫的幼虫及卵。
2、拌药消毒
在食用菌的生料栽培的过程中,对培养料进行拌料时,通常要加入0.1%多菌灵粉、或0.1%甲基托布津等杀菌剂,以杀死杂菌或抑制杂菌的生长。在堆制培养料时,常常加入1%~2%的生石灰,这不仅有消毒灭菌的作用,同时还可以调节培养料的pH值。
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二、热力灭菌
1、热力灭菌的原理
基质消毒灭菌包括对培养基、培养料中的微生物进行杀灭,它是食用菌纯培养的必要条件,一般采用热力灭菌。热力灭菌是一种物理的方法,其原理是利用高温使菌体蛋白变性,从而使酶失去活性,达到灭菌的目的。
自然界中的各种微生物,对生长发育的温度要求各有不同。低于其生长温度,微生物表现出生长缓慢,或处于休眠状态,一般不会致死,然而当温度高于微生物生长的适宜温度,就会影响到微生物酶的活性,表现出生理代谢的紊乱。在高温条件下,细胞内原生质发生凝固,酶结构完全破坏,生化反应停止,细胞死亡。
微生物不同,对高温的抵抗能力亦不同,根据微生物生长发育对温度的反应,可以分为三类:高温性、中温性和低温性。
各类微生物生长的温度范围
自然界中大多数微生物都属中温性生物,最适生长温度在25℃~37℃之间,多数低温性微生物在10℃~15℃之间,而高温微生物则适于在45℃~55℃生长。大多数霉菌、细菌、酵母的营养体和病毒在60℃以上,10min内可致死。放线菌和霉菌的孢子耐热性强,在75℃~80℃需10~15min才死亡。最耐热的是细菌的芽孢,在℃的沸水中需数小时才死亡。其原因是细菌的芽孢胞壁厚,热传导差,细胞内的水分多以结合水状态存在,自由水含量少,其新陈代谢又处于低水平,酶的活动几乎停止。因此,在高温的条件下,芽孢蛋白质对热有很强的抵抗力。一般短时间的常温灭菌,很难杀灭这些休眠体,例如枯草芽孢杆菌的芽孢在80℃,可存活75h,℃下存活3~4h,℃下可存活34~38min,℃下存活7~8min。
2、热力灭菌的主要方法
热力灭菌有多种方式,分为湿热灭菌和干热灭菌。湿热灭菌主要包括高压蒸气灭菌、常压蒸气灭菌、沸水灭菌、间歇灭菌等多种方法。干热灭菌主要包括火焰灭菌和干热高温灭菌。灭菌时,应根据被灭菌物料达到的无菌程度、物料的理化性质和生产上的设备状况来选择相应的灭菌方法。一般在同样温度下,湿热灭菌比干热灭菌的效果好,因为蒸气的穿透力强,原生质在含水量较高的情况下更易变性凝固。例如,蛋白质含水量为0时,经~min才能凝固;含水量在18%时,经80~90min就可凝固;当含水量在50%时,只要56min便可凝固。由此可见,在湿热处理下,杀灭微生物的时间要比干热灭菌短得多。
在食用菌栽培中,灭菌彻底与否是制作菌种和栽培实践最关键的一环,直接关系到培养料被杂菌污染与否,即关系到整个菇场生产的成功与否,应高度注意这一环节。
三、常压灭菌
灭菌是将料袋内的一切生物利用热能杀灭的一个过程。目前我国最普遍采用的方法是常压灭菌,而高压灭菌应用较少。
1、几种常压灭菌锅的建造和使用
(1)简易常压蒸汽灭菌锅
用1口直径85厘米的铁锅和砖、水泥搭建一个灶台,在灶台上方的房梁上顶部安放一个铁挂钩,并且用大棚塑料膜制作一个周长3米的塑料桶,上头用绳子系好吊在铁挂钩上,下部将锅上部的灭菌物罩住并且压在灶台上即可。这种类型的灭菌锅比较简单、成本低,但灭菌数量较少,适合初学者和小规模食用菌栽培户采用。
(2)圆形蒸汽灭菌灶
采用直径厘米的铁锅和砖、水泥搭建灶台,在灶台上用砖和水泥砌成~厘米的正方形灭菌室,高~厘米,上部用水泥封顶,在灭菌室下部预留一个加水口,并且安放一个铁管,在一侧留一个规格为宽×高=65×85厘米的进出料口,并且用木方作木门封进出料口;也可以用铁板焊制一个圆形的铁桶,直径厘米,高~厘米,在铁桶下部焊一个铁管做加水口,用塑料膜封锅口,这种类型的灭菌锅优点是半熟料灭菌出料方便,不易感染杂菌,适合1~2万袋栽培规模使用而且栽培品种为平菇熟料栽培、香菇熟料袋栽、滑菇半熟料盘栽和袋栽等。
(3)油桶灭菌锅
取旧汽油桶一个(里面的残留物要清洗干净),先用砖砌一个比桶高10厘米、比桶径宽10厘米的炉台,用10根16毫米粗、30厘米长的钢筋作为炉条,一侧留鼓风机风道。在桶壁的靠桶盖处焊1根钢管并装上阀门,以便加水和排污;在桶壁的另一面靠桶底处焊2根分管(上接黑胶管)排汽;在桶盖的一侧上下各焊一根4厘米长的细钢管(L形),中间接一根透明的塑料管作为水位计,然后将油桶卧放在炉台上。放置时注意桶盖向前,桶底向后,前低后高。靠桶底砌烟窗,尽量利用余热;两侧砌炉壁,以包住下半个油桶。这样一个简单的蒸汽发生器就成功了。
在炉台的一侧铺一块水泥地或铺2层薄膜(面积因料而定,上面铺砖或木棒然后堆料,排汽管放在料堆下面,上盖3—4层薄膜,四周用砖压好,然后开始烧火通气。通气时间为6—8小时,此后将料堆再闷一夜,然后接种。这样的炉台最好能在菇棚里也砌一个,冬季只需将油桶搬到棚里即可用蒸汽加温,一炉多用,生产任务紧时也可在炉台的另一侧再装一堆料,两堆料轮流灭菌,既省煤又省工省时,比土蒸锅方便、经济实用。
(4)常压灭菌小锅炉
常压灭菌过去多采用土蒸锅,用土蒸锅灭菌其缺点是装料少,装锅出锅操作不便,料冷却较慢,所以有逐渐淘汰的趋势,取而代之的是利用常压灭菌小锅炉(蒸气发生器),这种灭菌方法可节省燃料,操作方便,冷却也快。
常压小锅炉灭菌方法:先将灭菌场所打扫干净,再将已装满料袋的塑料筐一层一层摆好,一般一次可灭菌棒左右。用一层塑料布(旧塑料布可用二层)盖在上边,再覆盖一层苫布。如果是冬季苫布上边再盖棉被一层,四周用砂袋压好或用绳子捆好。这时可开始生火加温,开锅后蒸气通过管道进入菌棒垛内。为缩短垛内菌棒达到℃的时间,一般用两台小锅炉同时灭菌。大约3-5小时左右会发现苫布鼓起,我们称之为"园汽",即垛内温度达到℃以上,有时会达到℃。此时可开始计时并不间断灭菌12-14小时。如果用新塑料布覆盖,可在料垛的四个角下部分别放置四个铁管,让其自然排汽,以免垛内压力过高将整个覆盖物掀起。装好的菌袋不可久置应马上灭菌,以免培养料酸败,特别是在夏季更应注意。如灭菌过程中停电吹风机无法使用,可采用加高锅炉烟筒的方法继续灭菌,决不能停工待电。用两台小锅炉灭菌,加水的时间要错开,不能同时加水,使苫布始终保持鼓起状态。当灭菌结束,可停火使之自然降温冷却,在冷却过程中,夏季可将苫布掀掉,但塑料布不能掀掉。灭菌效果正常的菌棒表现为深褐色,有特殊香味,无酸臭味。袋内培养料PH值为6.5-7,并有轻微皱曲现象。在高海拔地区如内蒙鄂尔多斯(海拔米),青海门源县(海拔米)等,笔者用二台小锅炉同时灭菌,使料垛内保持一定压力,温度也可达到℃。在菌棒生产过程中,灭菌的效果是菌棒生产的关键。在生产实践中,一些新的栽培厂家,最容易出的问题就是灭菌这个环节。
2、常压灭菌的技术要点
培养基灭菌的彻底与否事关生产的成败,因此,常压灭菌时必须注意以下几点:
(1)必须保证常压灭菌灶(锅)内,下部培养料内温度连续10小时左右达到℃,计算时间应以锅内下部培养料达到℃开始,不能以水沸腾开始计算。
(2)培养料必须充分预湿,干湿不均匀的培养料灭菌不易彻底。
(3)锅内菌袋的码放最好排放在周转框或隔好的层架上,并呈“井”字型码放。
(4)控制灭菌前微生物自繁生物量,尤其是夏天气温高,拌料、装袋应尽可能安排在上午,装完袋后马上灭菌。最大限度的缩短拌料、装袋至灭菌达到℃的时间。
四、食用菌培养料诱发灭菌新技术
由于食用菌在整个生产过程中自始至终都是在与有害菌作斗争,其主要手段是克服污染。常规方法要求选用的原料新鲜、无霉变,但是实际上是不可能的。因此,食用菌在栽培时霉菌所带来的危害防不胜防,尤以发菌期最为严重,导致污染现象屡见不鲜。
食用菌栽培料堆制诱发灭菌技术就是在适宜的条件下促使杂菌孢子向营养转化,使本来难以杀死的杂菌孢子转变为容易杀死的营养生长体(即菌丝体)。
1、培养料加冰乙酸诱发
冰乙酸即无水乙酸,纯度95%,实践证明其具有强烈的杀虫、杀菌作用,长期用于食用菌不至产生抗药性及残留,对人畜安全无毒,它可取代常规高锰酸钾和甲醛用于空间消毒。用冰乙酸拌料,既可杀死虫卵,又可使杂菌孢子壁软化,有利于孢子吸收水分,使酶促反应增强,从而形成芽管。一般拌料使用浓度在0.3%-0.5%,陈料或污染严重的料应加大浓度至0.5%,新鲜料则以0.3%为宜。原料如棉子壳,加水量仍按常规要求使含水量在60%-65%,使原料充分翻拌均匀后,覆盖薄膜堆成高1米、宽1.5米、长不限的堆,24小时后可使95%以上的杂菌孢子萌发。冰乙酸若是46%浓度的应加大一倍以上的用量。
2、培养料堆制诱发
用来栽培食用菌的各种原料加水混合均匀后,使其含水量在60%-65%,通过堆制,由于有水分和养分的存在,自然微生物群大量繁殖并产生25-45摄氏度的高温,同时可促进杂菌孢子萌发。通常将加水后的原料堆成堆,堆外覆盖薄膜,冬季可借加温提高堆温。当料堆深度40厘米、温度到45摄氏度时即可翻堆,翻堆后仍堆成原状。当料温又上升到45摄氏度时,料中95%以上的孢子可得到萌发。
通过以上两种方法的诱发,使杂菌孢子露出较脆弱的芽管,若是生料栽培的品种,如平菇、鸡腿菇、猴头、金针菇等,用强碱——生石灰,加大用量将pH值调到14左右,杂菌孢子刚萌发的芽管极其脆弱,在强碱的作用下易被杀死。通过一段时间堆制,pH值下降且稳定在8.5-9时,即可装袋播种栽培。
针对有些不适宜生料栽培的品种,如香菇、木耳、栗蘑等,开始加入生石灰使pH值达14,最后稳定在8左右时,即时装袋、灭菌,常压下95摄氏度以上一个小时即可彻底灭菌。适宜生料栽培的品种开放式接种不污染,熟料才能生产的品种应在接种箱或接种帐中进行。
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五、食用菌母种、原种培养基灭菌
1、简法灭菌技术
湖北省宜都市食用菌天麻繁育场的科技人员经过多年探索实践,摸索出食用菌母种、原种培养基简法灭菌百分百不湿棉花塞技术。
该技术选用的灭菌设备为苏泊尔压力锅,即家庭做饭用的压力锅。盛装食用菌母种培养基的容器为18毫米×毫米或20毫米×毫米的无色玻璃试管;盛装食用菌原种培养基的容器为毫升或毫升的输液瓶即生理盐水瓶。
灭菌操作:向苏泊尔压力锅内注水5厘米深,按常规方法将制备好的食用菌母种、原种培养基分别盛入玻璃试管和输液瓶内,用棉花塞堵封试管口和输液瓶口。然后直接将玻璃试管和输液瓶直立于压力锅内,盖上锅盖,灭菌40~50分钟即可。
2、手提灭菌锅及其使用方法
(1)结构:
①手提灭菌锅由器身、器盖、内桶等部件组成;器身、器盖采用铝合金铸造成型;消毒内桶采用铝合金成型;器盖装有双刻度压力表、安全阀、放气阀、放气软管、密封胶圈各一个。
②工作压力:0.14~0.Mpa工作温度≥.5℃压力表工作范围:0~0.25Mpa安全阀开起压力≥0.Mpa安全阀回座压力≤0.14Mpa。
③内桶容积≥16升,总容积≥22升,每锅可灭试管培养基支(18×mm试管),毫升原种培养基21瓶(胜利瓶,去掉内桶),适于母种及少量原种生产。
(2)使用方法
①锅内加水约3升,水位掌握在低于内桶支撑角(不必担心水被耗干,正常使用情况下水的消耗量是很少的)。
②灭母种培养基要把试管竖立于铝桶内,灭原种培养基可去掉铝桶,锅底加一支架及箅子,原种瓶摆放在箅子上。
③盖锅时将放气软管插入内桶的软管架或插在原种瓶的间隙,竖起锅身的螺栓,对称拧紧。
④将放气阀打开(处于直立状态,目的是排除锅内的冷空气),加热,当放气阀有哧哧热气排出时,保持3~5分钟,关闭放气阀。压力达到0.13Mpa开始计时,并减小火势,使压力稳定在0.13~0.15Mpa之间。
⑤母种培养基灭菌30分钟,原种培养基灭菌2个小时。达到灭菌时间后,关闭火源,自然降温。母种培养基在凝固前摆放斜面,原种培养基冷却到40℃以下从锅中取出。
(3)注意事项:
①锅内灭菌用水不可重复使用,每灭一锅培养基都要进行更换。
②达到要求的灭菌压力时要及时控制火势,避免安全阀开起,防止对培养基的损害,同时也可以节约能源。
③开盖拧松螺栓前,首先将放气阀竖起;锅盖要错动一下后再提起。
④用完后的灭菌锅要将内桶及锅内的水倒出,并擦干存放。